蝦青素對D-半乳糖老齡大鼠骨質(zhì)影響
作者：裴凌鵬，董?；?，惠伯棣
作者單位：中國中醫科學(xué)院骨傷科研究所，北京 100700； 北京聯(lián)合大學(xué)應用文理學(xué)院
【摘要】 目的 研究ASTA蝦青素對D-半乳糖致衰老大鼠骨質(zhì)的影響。方法 用D-半乳糖注射Wistar雄性大鼠5個(gè)月，建立衰老模型，測定青年對照組、致衰老模型組、蝦青素組和正常老齡對照組骨常規參數并進(jìn)行比較分析。結果致衰老模型組骨密度、骨結構力學(xué)參數、生物力學(xué)參數、骨鈣、鎂、錳及羥脯氨酸含量與青年對照組比較有所降低，差異有統計學(xué)意義(P<001)；而骨磷含量、骨和血清堿性磷酸轉移酶與青年對照組比較有所升高，差異有統計學(xué)意義(P<001)；這些變化與正常老齡對照組的變化趨勢一致，并比后者變化得更顯著(zhù)。相比之下，蝦青素組在上述參數指標與致衰老模型組比較差異有統計學(xué)意義(P<001)。結論 長(cháng)期大量攝入D-半乳糖導致大鼠衰老同時(shí)可能誘發(fā)其發(fā)生骨質(zhì)變化，而蝦青素可以預防或降低此類(lèi)致衰老骨質(zhì)變化的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】 骨質(zhì)疏松,骨密度,羥脯氨酸,蝦青素
D-半乳糖衰老機制是指在一定時(shí)間內，給動(dòng)物連續注射大劑量的D-半乳糖，使機體細胞內半乳糖濃度增高。在醛糖還原酶的催化下，還原成半乳糖，該物質(zhì)不能被細胞進(jìn)一步代謝而堆積在細胞內，影響細胞的正常生理代謝，導致機體衰老。衰老過(guò)程常會(huì )伴隨著(zhù)老年性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，因此，利用致衰老模型探索致老年性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機制具有一定的研究?jì)r(jià)值。蝦青素是一種非維生素A原的羥酮式類(lèi)胡蘿卜素，廣泛存在于自然界的海洋動(dòng)物體、藻體及少數陸生植物體內并具有多種生物學(xué)功能，其中尤以抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力和抗癌作用明顯。本實(shí)驗旨在通過(guò)ASTA蝦青素對骨質(zhì)常參數如骨密度、骨結構力學(xué)參數、生物力學(xué)參數、主要骨礦物質(zhì)(鈣、鎂、錳、磷)、血清磷鈣、羥脯氨酸含量及堿性磷酸酶活性等來(lái)研究此類(lèi)化合物對D-半乳糖致衰老大鼠骨質(zhì)的影響。
1 材料與方法
11 主要儀器和試劑 Labconco冰凍真空干燥儀(法國樂(lè )高公司)；752分光光度計、AE100電子天平(中國伯樂(lè )公司)；電熱三用水箱、KA-1000型臺式離心機(中國杭州華亭公司)；960型熒光分光光度計、J2-SH高速冰凍離心機、Lunar-XR型雙能X線(xiàn)骨密度測定儀、島津萬(wàn)能實(shí)驗機、火焰原子吸收分光光度計(日本島津公司)；C30柱(YMC Carotenoid S-5,Waters)高效液相色譜(HPLC)(Waters 600E溶劑輸送系統，PDA-2996二極管陣列檢測器Waters),丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)測定度劑盒(南京建成生物工程研究所)；蝦青素乳化劑(瑞士羅氏公司)；乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚(MTBE)(美國迪馬公司)；無(wú)水乙醇(北京化學(xué)試劑公司)；大孔吸附樹(shù)脂(天津農業(yè)股份公司)。
12 乳化劑破乳制備蝦青素
121 蝦青素萃取 稱(chēng)取10g乳化顆粒，加入300ml丙酮-正己烷萃取。將脂溶性相收集，再進(jìn)行濃縮處理。
122 蝦青素提取液柱色譜純化 (1)裝柱：將活化好的氧化鋁裝填于玻璃層析柱中，用正己烷潤濕。(2)洗脫：分別取2ml蝦青素提取液上柱，用50ml正己烷-丙酮淋洗，收集洗脫液。將洗脫液用氮氣吹干制粉備用。
13 蝦青素鑒定 根據其高效液相色譜(HPLC)中保留時(shí)間和紫外可見(jiàn)吸收光譜的特征峰與標準品對照進(jìn)行鑒定。
14 動(dòng)物實(shí)驗
141 D-半乳糖致衰老動(dòng)物骨質(zhì)疏松癥模型的建立 6周齡Wistar雄性大鼠45只隨機分為3組，即致衰老模型組、青年對照組和蝦青素組，每組15只，另購16月齡同品系大鼠15只作為正常老齡對照組。致衰老模型組和蝦青素組每天用15g/(kg·bw)的D-半乳糖頸背部皮下注射，劑量為01ml/10g，其中蝦青素組每天每只以02ml灌喂20mg/(kg·bw)，所用蝦青素由本實(shí)驗室提供。青年對照組注射等量的生理鹽水，每天1次，連續注射5個(gè)月，自由進(jìn)食進(jìn)水。實(shí)驗結束時(shí)稱(chēng)量鼠的體重并取各組大鼠，稱(chēng)重后乙醚麻醉，暴露腹部，下腔靜脈取血，待測血清中MDA含量、血清鈣、血清磷、血清堿性磷酸酶(ALP)，血中SOD活性；分離各組大鼠的雙側股骨，測定骨長(cháng)度、骨質(zhì)量、骨密度、骨結構及生物力學(xué)指標；骨中鈣、磷、錳、鎂、羥脯氨酸含量和骨中ALP活性。
142 生化指標測定 MDA含量測定硫代巴比妥酸(TBA)比色法；SOD活性測定采用亞硝酸鹽法。
143 其他測定指標 血清ALP活性采用氨基氨替比啉測酚法測定；血清鈣用乙二胺四乙酸(EDTA)滴定法；血清磷采用孔雀綠微量比色法；骨中ALP采用化學(xué)免疫法試劑盒測定(中國科學(xué)院生物物理所中生公司)。
144 股骨骨密度測定 取股骨解凍后置于骨密度測定儀上，分近段、骨中段、遠段3部分測其骨密度。近段和遠段代表松質(zhì)骨骨密度，骨中段代表皮質(zhì)骨骨密度。測定參數：掃描寬度20nm，掃描速度7mm/s。
145 骨結構力學(xué)和生物力學(xué)的測定 取大鼠左股骨，用千分尺測量右側股骨的長(cháng)度；用分析天平稱(chēng)量?jì)蓚裙晒堑闹亓?；將股骨標本進(jìn)行3點(diǎn)彎曲實(shí)驗，得到載荷-撓度曲線(xiàn)。由此曲線(xiàn)可直接得出大鼠骨的結構力學(xué)參數(最大載荷、最大撓度、彈性載荷、彈性撓度)。測定參數為：下壓速度10mm/min;下壓幅度4mm；保持時(shí)間5s；跨度22mm。斷骨后，取股骨中部作徑向切片，在顯微鏡下用顯微盡測量股骨的最大外徑A、最小外徑B、最大內徑a、最小內徑b。并計算出大鼠股骨的各項生物力學(xué)指標。
146 骨中鈣、錳、鎂的含量 取大鼠右側股骨近端稱(chēng)重，研碎。然后進(jìn)行灰化2h。取出骨灰，硝酸溶解。經(jīng)處理后，火焰原子吸收分光光度計測定鈣、錳、鎂的含量。
147 骨中磷的含量 取大鼠右側股骨近端稱(chēng)重，研碎。然后進(jìn)行灰化2h。取出骨灰，硫酸溶解。經(jīng)處理后，用鉬藍顯色定磷法于660nm波長(cháng)下測定。
148 骨中羥脯氨酸的含量 取大鼠右側股骨上端稱(chēng)重，研碎。用3ml氯仿-甲醇處理2h，過(guò)濾。再用乙醇水和丙酮沖洗1次，放入烤箱2h。取出后放入1ml 12mol/l的HCl水解2h，取出后處理用氯胺T法于560nm波長(cháng)下測定。
15 統計分析 采用SPSS110統計軟件進(jìn)行齊性檢驗并作方差分析。
2 結果
21 蝦青素提取與鑒定 有機試劑的反復提取后，通過(guò)柱層析洗脫后可以得到高純度的蝦青素提取物，經(jīng)HPLC及其光譜特征峰鑒定為反式蝦青素單體。
22 D-半乳糖大鼠衰老模型建立 與青年對照相比，致衰老模型組血清MDA含量升高，而血液SOD活性均有所降低，與正常老齡對照組變化趨勢一致，說(shuō)明D-半乳糖大鼠衰老模型建立成功。而蝦青素組與致衰老模型組比較，血清MDA含量升高，血液SOD活性降低，且差異有統計學(xué)意義(P<001)。
表1 血清MDA含量和血液SOD活性（略）
注：各組與青年對照組比較，a P<005，b P<001；與致衰老模型組比較，c P<001
23 股骨結構力學(xué)、生物力學(xué)指標測定 與青年對照組比較，正常老齡對照組在股骨重量、長(cháng)度明顯增加，而致衰老模型組2項指標明顯減少。而在股骨密度、結構力學(xué)和生物力學(xué)指標方面表明，正常老齡對照組和致衰老模型組與青年對照組比較，差異有統計學(xué)意義(P<005)。正常情況下隨年齡的增長(cháng)，大鼠股骨長(cháng)度和重量都會(huì )相應增加，同時(shí)由于各種內外因素其股骨的結構力學(xué)和生物力學(xué)將呈現下降趨勢。實(shí)驗結果表明，注射D-半乳糖5個(gè)月可以達到改變股骨結構力學(xué)和生物力學(xué)的指標，且作用與正常老齡大鼠變化趨勢一致，證明在建立D-半乳糖致衰老模型的同時(shí)，也可以導致老年性骨質(zhì)疏松癥的可能。而蝦青素組與致衰老模型組比較，骨密度、結構力學(xué)和生物力學(xué)參數指標均有所升高，且差異有統計學(xué)意義(P<005)。
表2 股骨結構力學(xué)、生物力學(xué)指標（略）
注：各組與青年對照組比較，a P<005，b P<001；與致衰老模型組比較，c P<005,d P<001
24 骨礦物質(zhì)含量、血鈣磷及ALP活性 與青年對照組比較，致衰老模型組和正常老齡對照組骨鈣、錳、鎂及血磷含量均明顯減少，差異有統計學(xué)意義(P<001)，表明注射D-半乳糖的大鼠骨中幾種重要的礦物質(zhì)含量比同齡正常大鼠有所降低，而與正常老齡對照組的骨礦物質(zhì)含量變化趨勢一致。再次證明長(cháng)期服用D-半乳糖可以導致老年性骨質(zhì)疏松癥的可能。而蝦青素組與致衰老模型組相比，骨鈣、錳、鮮及血磷含量均明顯升高，且差異有統計學(xué)意義(P<001)。與青年對照組比較，致衰老模型組和正常老齡對照組骨中羥脯氨酸含量均明顯減少，差異有統計學(xué)意義(P<001)。致衰老模型組血清ALP和骨ALP活性與青年對照組比較顯著(zhù)升高；致衰老模型組與正常老齡對照組血清ALP活性比較也有所升高，2組變化趨勢一致。而蝦青素組與致衰老模型組比較，羥脯氨酸含量明顯升高，血清ALP和骨ALP活性較明顯降低，且差異有統計學(xué)意義(P<001)。
表3 骨礦物質(zhì)含量、血鈣磷及ALP活性測定（略）
注：各級與青年對照組比較，a P<005，b P<001；與致衰老模型組比較，c P<001,d P<001
3 討論
研究表明，大量的活性氧攝入會(huì )從整體、細胞和基因不同水平層次上影響骨的代謝過(guò)程。當大量進(jìn)食D-半乳糖會(huì )產(chǎn)生過(guò)多的自由基，在骨重建中，自由基可以破壞膠原蛋白形成，導致骨中礦物質(zhì)沉積減少，從而造成鈣、磷、鎂、錳等元素的流失，影響骨密度，抑制骨的形成，造成老年骨質(zhì)疏松。同時(shí)膠原蛋白加速分解生成羥脯氨酸并隨血、尿流失，且隨年齡而增加，使得骨中兩者的含量均相應減少。另外由于骨基質(zhì)結構建成受阻，同時(shí)礦物質(zhì)含量下降，從而使骨的結構力學(xué)和生物力學(xué)受到了影響，大大降低了骨的抗變性能力，提高了發(fā)生骨折的機率。研究發(fā)現，蝦青素可以有效地緩解增強成骨細胞增殖和分化，同時(shí)對局部細胞因子(如ALP酶、Ⅰ型膠原蛋白等)具有上調作用，表明蝦青素可能參與骨代謝有關(guān)調節活動(dòng)，再加上其極強的抗氧化能力，或許對致衰老性骨質(zhì)疏松癥具有一定預防或輔助治療意義。本實(shí)驗中青年對照組血清ALP活性低于致衰老模型組和正常老齡對照組，而致衰老模型組又高于正常老齡對照組，這可能是由于晚期糖化終末產(chǎn)物(AGEs)濃度增加，使破骨過(guò)程顯著(zhù)增強，成骨過(guò)程繼發(fā)增加，骨代謝處于一種高轉變狀態(tài)，成骨細胞的活躍造成血ALP活性增加。綜上所述，本實(shí)驗通過(guò)有關(guān)骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)指標檢驗，證實(shí)D-半乳糖誘導衰老大鼠過(guò)程的同時(shí)，可能誘發(fā)致衰老性骨質(zhì)疏松。而ASTA蝦青素可有效地緩解此類(lèi)致衰老性骨質(zhì)變化。
相關(guān)鏈接: http:/www.e-asta.cn/article-90.html#r-pwt90
蝦青素對D-半乳糖老齡大鼠骨質(zhì)影響
